本项成果提供了一种制备蛋白质的方法，其包括通过下列步骤：将C端具有酰肼基团的第一肽与N端为半胱氨酸的第二肽连接：将所述第一肽与所述第二肽在含有NaNO2的溶液中混合并调节pH至酸性，以便将所述第一肽的酰肼基团转化为酰基叠氮基团得到第一反应混合物；向所述第一反应混合物中添加含有巯基基团的还原剂溶液并调节pH至中性，以便所述第一肽的酰基叠氮基团转化为硫酯基团，维持所述中性pH进而所述第一肽的C端硫酯与所述第二肽的N端发生连接反应形成蛋白质。本项成果还提供了多肽硫酯化物的制备方法。